研究紫草素抑制白色念珠菌的材料和方法

2020-10-27 11:41:20

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种: 白色念珠菌(Candida albicans ATCC10231),购自中国医学菌种保藏中心。

1.1.2 培养基与试剂: 沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)、RPM-1640液体培养基和酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YEPD);蛋黄培养基;紫草素标准品购于成都曼斯特股份有限公司。

1.1.3 主要实验仪器设备: 酶标仪(Thermo MULTISKAN ASCENT);PCR仪(英国TTECHNE-512型);实时荧光定量PCR仪(日本TAKARATP800);电泳凝胶定量分析系统(Bio-Rad公司,Version 3.1);扫描电镜(KYKY-1000B);激光共聚焦显微镜(Zeizz LSM 710,German)。

1.2 紫草素对白色念珠菌的抑制作用测定

将200 μL培养至对数期的白色念珠菌的菌悬液(106 CFU/mL)分别加入96孔板中,再加入20μL不同浓度的紫草素药液,使其终浓度分别为64、32、16、8、4μg/mL,37℃培养24h后于595 nm处测定吸光值。以不加药物组为空白对照。实验重复3次,取平均值。其中,紫草素对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)值为菌体的OD值下降80%以上的最低药物浓度。从大于MIC的各孔中分别取10μL菌悬液涂布于SDA固体培养基上,37℃培养48h后观察菌体生长情况,最低杀菌浓度(MFC)为平板上没有菌体生长的最低药物浓度。

1.3 紫草素对白色念珠菌细胞膜渗透性的影响

将培养至对数期的菌悬液按2%接种量接种于20mL RPM-1640液体培养基中,以150r/min、30℃恒温培养16h后,离心弃上清液,用PBS洗涤菌体2次,制成适当浓度的白色念珠菌菌悬液,分别向其中加入浓度为MIC和2MIC的紫草素继续培养12h,每隔2h分别取样液4mL,4000r/min离心10min弃沉淀,用紫外分光光度计于260nm下测定上清液中DNA和RNA等大分子物质的变化。以不加药为空白对照组,实验重复3次,取平均值。

1.4 紫草素对白色念珠菌形态的影响

将培养至对数期的白色念珠菌菌悬液(107 CFU/mL)接种于含紫草素终浓度为MIC的YEPD液体培养基中,150r/min、30℃振荡培养。于6h和16h分别取1mL菌悬液,3000r/min离心5min后弃上清。再加入0.5mL PBS缓冲液和0.5mL 2.5%的戊二醛,4℃冰箱固定过夜。次日用PBS缓冲液冲洗2次,50%、80%、100%乙醇依次脱水1次,每次15min,100%乙醇浸没的电镜样品置4℃冰箱中降温10min后,放入真空干燥器中干燥40min。待干燥后的样品温度升至室温后取出,喷金镀膜,使用扫描电镜观察照相,以不加药组为空白对照,实验重复3次。

1.5 紫草素对白色念珠菌细胞内钙离子浓度的影响

将2mL RPM-1640培养基及300μL培养至对数期的菌悬液(106CFU/mL)分别加入6孔板中,每孔内分别放一片无菌盖玻片,37℃培养4h后,以加入300μL浓度为MIC的紫草素的孔为实验组,加入300μL去离子水的孔为空白对照组,37℃下继续培养16h。然后吸出每孔中的液体,用PBS缓冲液洗涤2次。阴干后于避光环境下向每孔中加入1mL 5μmol/L的钙离子荧光探针(Fluo-3AM),于37℃培养箱中孵育45min进行探针装载。吸出剩余的荧光探针染液并用PBS缓冲液冲洗,置于37℃培养箱中继续孵育15min,以确保Fluo-3AM完全转变为Fluo-3。取出盖玻片,用10μL抗荧光淬灭剂进行封片后,利用激光共聚焦显微镜检测荧光强度,并按照公式(1)计算钙离子浓度([Ca2+])变化百分率。实验重复3次。


1.6 紫草素对白色念珠菌分泌胞外磷脂酶(phosphlipase,PL)的影响

制备10μL含紫草素终浓度为1/2MIC和MIC的菌悬液(106 CFU/mL)并用移液枪接种于卵黄培养基上,以加等量PBS的菌悬液为空白对照,于37℃下培养48h。待培养结束后,用刻度尺分别测量平板上的菌落直径和沉淀圈直径,每组实验重复3次,取平均值。磷脂酶的活性用PZ值表示,PZ值按下列公式计算。PZ值=菌落直径/总直径。总直径=菌落直径+菌落周围沉淀圈的直径。PZ=1,表示无磷脂酶活性;PZ值<1,表示有磷脂酶活性,且PZ值越大,磷脂酶的活性越弱。

1.7 紫草素对白色念珠菌PLB1和PLB2相对表达量的影响

1.7.1 白色念珠菌PLB1和PLB2基因的检测: 提取模板DNA,根据GenBank中已发布的白色念珠菌的基因序列,利用Primer 5.0软件及参考文献设计磷脂酶相关基因PLB1和PLB2的上下游引物,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。PCR扩增条件为94℃ 5min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 45s,30个循环;72℃ 10min。

1.7.2 紫草素对白色念珠菌PLB1和PLB2相对表达量的影响: 将培养至对数期的菌悬液接种到含紫草素终浓度分别为1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC的RPM-1640培养基中,30℃、150 r/min培养16h后,采用Trizol法提取RNA,用微量核酸测量仪进行RNA浓度的定量。采用2步法反转合成模板cDNA,根据设计合成RT-PCR引物进行扩增。以18SrRNA为内参基因,以不加药物组为空白对照。待反应结束后分析RT-PCR的扩增曲线和融解曲线,并计算PLB1和PLB2基因的相对表达量。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0及Curve Expert 1.3统计软件进行分析,数值用均数±标准差(x±s)表示。予以卡方检验和t检验。以P<0.05为具有统计学意义。

2 结果和分析

2.1 紫草素对白色念珠菌的抑制作用

实验结果显示,紫草素对白色念珠菌有显著的抑制和杀灭作用,且呈浓度剂量依赖。其抑杀白色念珠菌的MIC和MFC分别为16 μg/mL和32 μg/mL。

2.2 紫草素对白色念珠菌细胞膜渗透性的影响

实验结果显示(图 1),紫草素能导致细胞内DNA和RNA等大分子物质的泄漏,其中MIC的紫草素作用菌体12 h后,上清液中的DNA和RNA等大分子含量与对照组相比增加了117.32% (P < 0.01),表明紫草素可破坏白色念珠菌细胞膜的完整性,使细胞膜的通透性大大增加。

2.3 紫草素对白色念珠菌细胞形态的影响

扫描电镜结果显示(图 2),MIC紫草素作用白色念珠菌后,其细胞形态发生了明显的改变。其中对照组的白色念珠菌(图 2-A),形态规则、外观饱满、表面光滑致密、折光性好。而加药处理6 h后(图 2-B),细胞表面开始变得粗糙,扭曲变形。当药物作用菌体16 h后(图 2-C),大部分菌体严重皱缩、干瘪、扭曲变形,菌体表面凹凸不平,形成囊泡状或不规则的突起结构。

2.4 紫草素对白色念珠菌钙离子通透性的影响

利用钙离子荧光探针Fluo-3 AM检测细胞内[Ca2+]变化的原理,是Fluo-3 AM进入菌体细胞后,能在细胞内水解酶的作用下水解成Fluo-3,Fluo-3与细胞内钙离子的结合物能在激发光下产生特异的荧光。荧光强度可反映细胞内的[Ca2+],荧光强度越弱,表示细胞内[Ca2+]流失的越多,细胞膜的损伤越严重。激光共聚焦显微镜结果显示(图 3),紫草素能显著降低白色念珠菌细胞内的[Ca2+],与对照组相比,MIC的紫草素能使白色念珠菌细胞内的[Ca2+]降低72.02% (P < 0.01)。表明紫草素能够破坏白色念珠菌细胞膜的完整性使细胞膜的通透性大大增加。

2.5 紫草素对白色念珠菌分泌的胞外磷脂酶的影响

采用卵黄培养基平板法检测磷脂酶的原理,是菌体分泌到细胞外的磷脂酶能将培养基中所含的磷脂分解成脂肪酸,脂肪酸与培养基中的钙反应能形成脂肪酸钙沉淀圈。因此根据形成的沉淀圈的大小,即可判断菌体分泌磷脂酶的活性。本实验结果显示(表 3),不同浓度的紫草素均可抑制白色念珠菌分泌磷脂酶,且呈浓度剂量依赖。其中,与对照组相比,MIC的紫草素能使白色念珠菌分泌磷脂酶的量下降56.3% (P < 0.01)。

2.6 紫草素对白色念珠菌PLB1和PLB2基因相对表达量的影响

PCR结果显示,白色念珠菌中存在编码磷脂酶B的相关基因PLB1和PLB2基因(图 4)。RT-PCR结果显示(图 5),紫草素可降低PLB1和PLB2基因的相对表达量,且呈浓度剂量依赖。其中1/2MIC的紫草素作用白色念珠菌16 h后,与对照组相比,PLB1和PLB2基因的相对表达量分别降低了56.4%和61.4% (P < 0.01)。